Отличие репликации in Vivo от амплификации

ля работы с нуклеотидными последовательностями в генах и других участках ДНК необходимо иметь достаточное количество материала для исследования. Это непростая задача, особенно если источником ДНК служат ткани человека. Поэтому исследуемые фрагменты ДНК обычно предварительно амплифицируют (увеличивают количественно в миллионы раз), для того чтобы получать их в любое время и в неограниченном количестве. Исключительно ценным инструментом в решении этой проблемы оказалось использование рекомбинантных ДНК (т.е. ДНК, построенных из участков разного происхождения).

1. Получение рекомбинантных ДНК

Для получения таких молекул первоначально выделяют ДНК из 2 разных источников (рис. 4-65).

Рис. 4-65. Получение рекомбинантных ДНК. Два образца ДНК: ДНКХ и ДНКУ расщепляют одной и той же рестриктазой и получают фрагменты с «липкими» концами. При денатурации и последующем «отжиге» образуются рекомбинантные молекулы ДНКд и ДНКБ, первоначально соединённые друг с другом за счёт «липких» концов, затем сшиваемых ДНК-лигазой

Репликация ДНК — биология и физиология клетки

Каждую из них в отдельности фрагментируют, используя одну и ту же рестриктазу, расщепляющую ДНК с образованием «липких» концов. После процедуры нагревания и медленного охлаждения (отжига) наряду с исходными молекулами ДНКХ и ДНКУ могут образовываться рекомбинантные молекулы, состоящие из фрагментов ДНКХ и ДНКу связанных между собой «липкими» копнами. Ковалентное сшивание фрагментов осуществляют с помощью ДНК-лигазы в присутствии АТФ как источника энергии.

В технологии рекомбинантных ДНК, кроме фрагментов ДНК, выделенных из клеток, содержащих ядра, используют ДНК, полученную с помощью обратной транскриптазы. При добавлении в реакционную среду 4 разных дезокси-рибонуклеозидтрифосфатов фермент на матрице мРНК по принципу комплементарности синтезирует ДНК-копию, или кДНК. Так как источником информации при образовании кДНК служит зрелая цитоплазматическая мРНК, то такая ДНК, в отличие от ДНК фрагментов, полученных при расщеплении геномной ДНК. эукариотов, не содержит интронов.

2. Клонирование ДНК

Для получения значительных количеств интересующего нас материала проводят клонирование ДНК, предполагающее встраивание нужного нам фрагмента ДНК в векторную молекулу ДНК (или вектор). Вектор обеспечивает проникновение этой рекомбинантной, или химерной, ДНК в бактериальные клетки. В качестве векторов используют плазмиды, фаги, ретро- и аденовирусы. Особенно часто в качестве вектора служит плазмидная ДНК.

Плазмиды — небольшие кольцевые двух цепочечные молекулы ДНК, присутствующие в бактериальных клетках в различном количестве копий. Они имеют автономную систему контроля репликации, которая поддерживает их количество в клетках на определённом уровне — от нескольких единиц до нескольких сотен копий геномов на клетку.

Используемую для клонирования плазмидную ДНК и интересующую нас ДНК расщепляют по определённому участку ресгриктазой, получают рекомбинантную ДНК, возвращают гибридную плазмиду в кольцевую форму и вводят в бактериальные клетки, т.е. осуществляют трансформацию бактерий. При размножении трансформированных бактерий происходит увеличение числа копий введённого в плазмиду фрагмента ДНК, г.е. таким способом чужеродный для бактерий генетический материал может быть получен в значительных количествах (рис. 4-66).

Репликация ДНК | самое простое объяснение

Рис. 4-66. Схема клонирования ДНК в бактериальных клетках

В качестве клонирующих векторов часто используют фаги. Если экзогенную ДНК вводят в эукариотические клетки, то эту процедуру пазы вают трансдукцией.

3. Полимеразная цепная реакция

Метод полимеразной цепной реакции (ПЦР), предложенный в 1983 г. Карри Мулл и сом (Нобелевская премия. 1993 г.), явился эпохальным открытием XX века в области молекулярной биологии. Он позволяет подвергать специфичной амплификации в условиях in vitro (в пробирке) участки ДНК длиной от нескольких десятков до нескольких сотен пар нуклеотидов, используя в качестве матрицы любые образцы ДНК.

Необходимое условие для проведения ПЦР — знание нуклеотидной последовательности амплифици-руемой области. Участок исследуемой ДНК гибридизуют с двумя искусственно синтезированными праймерами — олигодезоксирибонук-леотидными последовательностями длиной от 15 до 30 пар нуклеотидов, которые комплементарны 3′-концам амплифицируемого участка на кодирующей и некодирующей нитях ДНК. Расстояние между праймерами определяет длину синтезируемых молекул. В качестве матрицы для синтеза продуктов ПЦР используют любой тип ДНК: геномную ДНК человека, различных видов про- и эукариотов, ДНК, выделенную из культур клеток, «библиотек» генов и других источников. Метод не требует больших количеств исследуемой ДНК, в принципе, достаточно даже одной молекулы, содержащейся в одном волосе на голове, одной капле крови или спермы.

Успех в разработке метода в значительной степени обусловлен использованием в качестве фермента термофильной ДНК-полимеразы, выделенной из бактерий, живущих в горячих источниках, и потому устойчивой к действию высоких температур.

Реакционная смесь для получения интересующей нас ДНК содержит исследуемую ДНК, субстраты реакции — 4 дНТФ, 2 праймера, термостабильную, или Taq-полимеразу и буфер, содержащий ионы Mg 2+ .

Один цикл полимеризации включает 3 этапа (рис. 4-67):

Рис. 4-67. Полимеразная цепная реакция

плавление: на этой стадии реакционную смесь нагревают до температуры 90—97 °С. Исследуемая двуцепочечная ДНК денатурирует и переходит в однонитевую форму;

гибридизация или отжиг ДНК с праймерами В результате снижения температуры до 50-60 °С происходит комплементарное связывание праймеров с цепями матричной ДНК и образование двухцепочечного участка на каждой из нитей ДНК;

Затем снова наступает этап плавления, когда за счёт повышения температуры синтез ДНК прекращается, и двунитевой участок между матричными и вновь синтезированными молекулами ДНК денатурирует. Во втором и последующих циклах праймеры гибридизируются с исходной матричной ДНК и с вновь синтезированными молекулами ДНК, количество которых нарастает в геометрической прогрессии. В последнем случае синтез ДНК заканчивается не из-за изменения температурного режима, а по достижении ДНК-полимеразой границы амплифицированного участка, что определяет строго определённый размер продукта с точностью до одного нуклеотида.

Каждый из этапов цикла имеет продолжительность от десятков секунд до 1—3 мин, в результате полный цикл длится от одной до нескольких минут.

Описанную процедуру амплификации ДНК проводят в автоматическом режиме в приборе — циклизаторе, или термоциклере, амплификаторе ДНК. Такой прибор позволяет задавать нужное количество циклов и выбирать оптимальные временные и температурные параметры. За 25—30 циклов число синтезированных копий ДНК достигает нескольких миллионов.

С помощью ПЦР можно получить достаточное количество копий участков ДНК, в которых предполагаются присутствие мутаций, полиморфизм сайтов, можно проводить ДНК-диагнос-тику инфицированности пациентов вирусными, бактериальными и грибковыми возбудителями болезней.

Источник: tepka.ru

Синтез ДНК — DNA synthesis

Структура двухцепочечной ДНК, продукта синтеза ДНК, с указанием отдельных нуклеотидных звеньев и связей.

Синтез ДНК это естественное или искусственное создание дезоксирибонуклеиновая кислота (ДНК) молекулы. ДНК — это макромолекула состоит из нуклеотид единицы, которые связаны ковалентными связями и водородными связями, в повторяющейся структуре.

Синтез ДНК происходит, когда эти нуклеотидные единицы соединяются вместе с образованием ДНК; это может происходить искусственно (in vitro) или естественно (in vivo). Нуклеотидные единицы состоят из азотистого основания (цитозин, гуанин, аденин или тимин), пентозного сахара (дезоксирибоза) и фосфатной группы. Каждая единица соединяется, когда между ее фосфатной группой и пентозным сахаром следующего нуклеотида образуется ковалентная связь, образуя сахарно-фосфатный остов. ДНК представляет собой комплементарную двухцепочечную структуру, поскольку специфическое спаривание оснований (аденин и тимин, гуанин и цитозин) происходит естественным образом, когда между нуклеотидными основаниями образуются водородные связи.

Есть несколько разных определений синтеза ДНК: он может относиться к Репликация ДНК — биосинтез ДНК (in vivo Амплификация ДНК), полимеразной цепной реакции — ферментативный синтез ДНК (in vitro Амплификация ДНК) или синтез генов — физически создающий искусственные генные последовательности. Хотя каждый тип синтеза очень отличается, у них действительно есть некоторые общие черты: нуклеотиды, которые были соединены для образования полинуклеотиды может действовать как матрица ДНК для одной формы синтеза ДНК — ПЦР. Репликация ДНК также работает с использованием шаблона ДНК, двойная спираль ДНК раскручивается во время репликации, подвергая неспаренные основания для новых нуклеотидов водородной связи. Однако для синтеза генов не требуется матрица ДНК, и гены собираются. de novo.

Синтез ДНК происходит во всех эукариоты и прокариоты, а также некоторые вирусы. Точный синтез ДНК важен для предотвращения мутаций ДНК. У людей мутации могут приводить к таким заболеваниям, как рак, поэтому синтез ДНК и задействованные механизмы in vivo, широко изучалась на протяжении десятилетий. В будущем эти исследования могут быть использованы для разработки технологий, включающих синтез ДНК, которые будут использоваться для хранения данных.

• 1 Репликация ДНК

• 1.1 Синтез репарации ДНК

• 3.1 Случайный мутагенез
• 3.2 ОТ-ПЦР

• 4.1 Синтез олигонуклеотидов
• 4.2 Синтез пары оснований

Репликация ДНК

Обзор этапов репликации ДНК

Репликация ДНК и различные задействованные ферменты

В природе молекулы ДНК синтезируются всеми живыми клетками в процессе репликации ДНК. Обычно это происходит при делении клеток. Репликация ДНК происходит так, что во время деления клетки каждая дочерняя клетка содержит точную копию генетического материала клетки.

В естественных условиях Синтез ДНК (репликация ДНК) зависит от сложного набора ферментов, которые эволюционировали, чтобы действовать во время Фаза S клеточного цикла согласованным образом. И у эукариот, и у прокариот репликация ДНК происходит, когда специфические топоизомеразы, геликазы и гиразы (белки-инициаторы репликации) разматывать двухцепочечная ДНК, обнажающая азотистые основания. [1] Эти ферменты вместе с дополнительными белками образуют макромолекулярную машину, которая обеспечивает точное дублирование последовательностей ДНК. Происходит комплементарное спаривание оснований, образуя новую двухцепочечную молекулу ДНК. Это известно как полуконсервативный репликация, поскольку одна цепь новой молекулы ДНК происходит от «родительской» цепи.

Эукариотические ферменты постоянно сталкиваются с повреждениями ДНК, которые могут нарушить репликацию ДНК. Это повреждение имеет форму повреждений ДНК, которые возникают спонтанно или из-за агентов, повреждающих ДНК. Поэтому механизмы репликации ДНК строго контролируются, чтобы предотвратить коллапс при повреждении. [2] Контроль системы репликации ДНК гарантирует, что геном реплицируется только один раз за цикл; чрезмерная репликация вызывает повреждение ДНК. Нарушение регуляции репликации ДНК является ключевым фактором нестабильности генома во время развития рака. [3]

Это подчеркивает специфику механизма синтеза ДНК. in vivo. Существуют различные способы искусственного стимулирования репликации естественной ДНК или создания искусственных генных последовательностей. Однако синтез ДНК in vitro может быть очень подверженным ошибкам процессом.

Синтез репарации ДНК

Поврежденная ДНК подлежит ремонту несколькими разными ферментативные процессы восстановления, где каждый отдельный процесс специализируется на устранении определенных типов повреждений. ДНК человека может быть повреждена из нескольких природных источников, и недостаточное восстановление связано с болезнями и преждевременное старение. [4] Большинство процессов репарации ДНК формируют одноцепочечные разрывы в ДНК на промежуточной стадии репарации, и эти разрывы заполняются репарационным синтезом. [4] Конкретные процессы репарации, требующие заполнения пробелов путем синтеза ДНК, включают: эксцизионная репарация нуклеотидов, базовая эксцизионная пластика, ремонт несоответствия, гомологичный рекомбинационный ремонт, негомологичное соединение концов и соединение концов, опосредованное микрогомологией.

Обратная транскрипция

Обратная транскрипция является частью цикла репликации определенных семейств вирусов, включая ретровирусы. Он включает копирование РНК в двухцепочечную комплементарную ДНК (кДНК) с использованием обратная транскриптаза ферменты. В ретровирусах вирусная РНК вставляется в ядро ​​клетки-хозяина. Там фермент обратной транскриптазы вируса добавляет нуклеотиды ДНК к последовательности РНК, генерируя кДНК, которая вставляется в геном клетки-хозяина ферментом. интегрировать, кодирующие вирусные белки. [5]

Полимеразной цепной реакции

А полимеразной цепной реакции представляет собой форму ферментативного синтеза ДНК в лаборатории с использованием циклов повторного нагрева и охлаждения реакции для Плавление ДНК и ферментативная репликация ДНК.

Синтез ДНК во время ПЦР очень похож на синтез живых клеток, но имеет очень специфические реагенты и условия. Во время ПЦР ДНК химически извлекается из белков-шаперонов хозяина, затем нагревается, вызывая термическую диссоциацию нитей ДНК. Две новые цепи кДНК построены из исходной цепи, эти цепи можно снова разделить, чтобы они действовали как матрица для других продуктов ПЦР. Исходная ДНК размножается с помощью многих раундов ПЦР. [1] Можно сделать более миллиарда копий исходной цепи ДНК.

Случайный мутагенез

Для многих экспериментов, таких как структурные и эволюционные исследования, ученым необходимо создать большую библиотеку вариантов определенной последовательности ДНК. Случайный мутагенез происходит in vitro, когда мутагенная репликация с использованием ДНК-полимеразы низкой точности сочетается с селективной амплификацией ПЦР для получения множества копий мутантной ДНК. [6]

ОТ-ПЦР

ОТ-ПЦР отличается от обычной ПЦР тем, что синтезирует кДНК из мРНК, а не из матричной ДНК. Этот метод сочетает реакцию обратной транскрипции с амплификацией на основе ПЦР, поскольку последовательность РНК действует как матрица для фермента обратной транскриптазы. ОТ-ПЦР часто используется для проверки экспрессии генов в определенных тканях или типах клеток на различных стадиях развития или для проверки генетических нарушений. [7]

Синтез генов

Искусственный синтез генов это процесс синтеза ген in vitro без необходимости в первичных образцах матричной ДНК. в 2010 г. Дж. Крейг Вентер и его команда были первыми, кто использовал полностью синтезированную ДНК для создания самовоспроизводящегося микроба, получившего название Лаборатория микоплазм. [8]

Синтез олигонуклеотидов

Синтез олигонуклеотидов это химический синтез последовательностей нуклеиновых кислот. Большинство биологических исследований и биоинженерии включает синтетическую ДНК, которая может включать олигонуклеотиды, синтетические гены или даже хромосомы. Сегодня вся синтетическая ДНК создается на заказ с использованием фосфорамидитного метода. Марвин Х. Карутерс.

Олиго синтезируются из строительных блоков, которые копируют природные основы. Этот процесс автоматизирован с конца 1970-х годов и может использоваться для формирования желаемых генетических последовательностей, а также для других целей в медицине и молекулярной биологии. Однако создание последовательностей химическим путем нецелесообразно за пределами 200–300 оснований и является экологически опасным процессом. Эти олигонуклеотиды, состоящие примерно из 200 оснований, могут быть связаны с использованием методов сборки ДНК, создавая более крупные молекулы ДНК. [9]

Некоторые исследования изучали возможность ферментативного синтеза с использованием терминальная дезоксинуклеотидилтрансфераза (TdT), ДНК-полимераза, не требующая матрицы. Однако этот метод еще не так эффективен, как химический синтез, и коммерчески недоступен. [10]

С развитием искусственного синтеза ДНК изучается возможность хранения данных ДНК. Благодаря сверхвысокой плотности хранения и долговременной стабильности синтетическая ДНК представляет собой интересный вариант для хранения больших объемов данных. Хотя информацию можно очень быстро получить из ДНК с помощью технологий секвенирования нового поколения, синтез ДНК de novo является основным узким местом в этом процессе. За цикл можно добавить только один нуклеотид, причем каждый цикл занимает секунды, поэтому общий синтез занимает очень много времени, а также очень подвержен ошибкам. Однако, если биотехнология улучшится, синтетическая ДНК однажды может быть использована для хранения данных. [11]

Синтез пары оснований

Сообщается, что новые азотистое основание пары могут быть синтезированы, а также A-T (аденин — тимин ) и G-C (гуанин — цитозин ). Синтетические нуклеотиды могут использоваться для расширения генетического алфавита и обеспечения специфической модификации участков ДНК. Даже всего лишь третья пара оснований увеличила бы количество аминокислот, которые могут кодироваться ДНК, с существующих 20 аминокислот до возможных 172. [8] ДНК Хатимодзи состоит из восьми букв нуклеотидов, образующих четыре возможных пары оснований. Таким образом, это вдвое больше плотности информации естественной ДНК. Согласно исследованиям, РНК даже была произведена из ДНК хатимоджи. Эта технология также может использоваться для хранения данных в ДНК. [12]

Рекомендации

1. ^ аб Пельт-Веркуил, Эван (2008). «Краткое сравнение между репликацией ДНК in vivo и амплификацией ПЦР in vitro». Принципы и технические аспекты амплификации ПЦР (PDF) . Роттердам: Springer, Нидерланды. С. 9–15. Дои:10.1007/978-1-4020-6241-4_2. ISBN978-1-4020-6240-7 . S2CID215257488.
2. ^ Patel, Darshil R .; Вайс, Роберт С. (2018). «Трудная ссора: когда репликационные вилки сталкиваются с повреждением ДНК». Biochem Soc Trans. 46 (6): 1643–1651. Дои:10.1042 / BST20180308. ЧВК6487187 . PMID30514768.
3. ^ Ройссвиг, Карл-Уве; Пфандер, Борис (2019). «Контроль инициации репликации эукариотической ДНК — механизмы обеспечения плавных переходов». Гены (Базель). 10 (2): 99. Дои: 10.3390 / гены10020099 . ЧВК6409694 . PMID30700044.
4. ^ аб Тивари V, Уилсон DM 3-й. Повреждение ДНК и связанные с ним дефекты репарации ДНК при заболеваниях и преждевременном старении. Am J Hum Genet. 2019 1 августа; 105 (2): 237-257. DOI: 10.1016 / j.ajhg.2019.06.005. Рассмотрение. PMID: 31374202
5. ^ Хьюз, Стивен Х (2015). «Обратная транскрипция ретровирусов и ретротранспозонов LTR». Микробиологический спектр. 3 (2): 1051–1077. Дои:10.1128 / microbiolspec.MDNA3-0027-2014. ISBN9781555819200 . ЧВК6775776 . PMID26104704.
6. ^ Форлони, М (2018). «Случайный мутагенез с использованием ДНК-полимераз, подверженных ошибкам». Холодный источник Харб Проток. 2018 (3): pdb.prot097741. Дои:10.1101 / pdb.prot097741. PMID29496818.
7. ^ Бахман, Юлия (2013). «Глава вторая — ПЦР с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР)». Методы в энзимологии. 530: 67–74. Дои:10.1016 / B978-0-12-420037-1.00002-6. PMID24034314.
8. ^ аб Файкс, Брэдли Дж. (8 мая 2014 г.). «Жизнь, созданная с помощью расширенного генетического кода». Сан-Диего Union Tribune. Архивировано из оригинал 9 мая 2014 г. . Получено 8 мая 2014 .
9. ^ Паллюк, Себастьян; Арлоу, Дэниел Х; и другие. (2018). «Синтез ДНК de novo с использованием конъюгатов полимераза-нуклеотид». Природа Биотехнологии. 36 (7): 645–650. Дои:10.1038 / nbt.4173. OSTI1461176. PMID29912208. S2CID49271982.
10. ^ Перкель, Джеффри М. (2019). «Гонка за ферментативный синтез ДНК накаляется». Природа. 566 (7745): 565. Дои: 10.1038 / d41586-019-00682-0 . PMID30804572.
11. ^ Табатабаи, С. Касра (2020). «Перфокарты ДНК для хранения данных о нативных последовательностях ДНК с помощью ферментативного разрезания». Nature Communications. 11 (1): 1742. Дои: 10.1038 / s41467-020-15588-z . ЧВК7142088 . PMID32269230.
12. ^ Хошика, Шуичи (2020). «ДНК и РНК Хатимодзи. Генетическая система с восемью строительными блоками». Наука. 363 (6429): 884–887. Дои:10.1126 / science.aat0971. ЧВК6413494 . PMID30792304.

Источник: wikidea.ru

Полимеразная цепная реакция (ПЦР): что это за метод, как работает, компоненты реакции, применение ПЦР, преимущества

Наверное, каждый врач сталкивался в своей практике с такими случаями — никакой явновыраженной сиптоматики, микробиологические исследования — в пределах нормы, а у пациента температура две недели не падает, или простатит рецидивирующий, или еще какая-то болячка, с которой не удается справиться.

А истинную причину выяснить ну никак не удается.

Мистика? Непрофессионализм? Нет.

Это недостатки диагностики. Иногда вирус или бактерия могут находиться в крови столь малых количествах, что чувствительность традиционных методов диагностики не позволяет их выявить.

А они, тем временем, делают свое темное дело, нанося порою непоправимый вред организму. Но ситуация меняется. теперь на вооружении у врачей есть тонкий высокочувствительный метод диагностики — полимеразная цепная реакция (ПЦР).

В настоящее время ПЦР является самым чувствительным и самым точным методом диагностики инфекционных заболеваний.

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) — экспериментальный метод молекулярной биологии, который позволяет получить значительное увеличение количества определенных участков ДНК из биологических проб, в которых исходная ДНК содержится в сверхмалых количествах.

Помимо амплификации ДНК, ПЦР позволяет производить множество других манипуляций с нуклеиновыми кислотами – расщепление или сращивание участков ДНК, введение мутаций. Поэтому метод ПЦР нашел свое практическое применение в лабораторной диагностике инфекционных заболеваний, определении отцовства , в клонировании и в генной инженерии.

Первые опыты по амплификации ДНК с помощью пары коротких одноцепочечных молекул ДНК, названных праймерами, проводил еще норвежский ученый Хьеллю Клеппе в 70-е годы прошлого столетия. Но его идея так и осталась нереализованной. И только спустя почти десять лет, в 1983 году полимеразная цепная реакция была открыта американским биохимиком Кэри Муллисом.

Его целью было создание метода, который бы позволил амплифицировать ДНК в ходе многократных последовательных удвоений исходной молекулы ДНК с помощью фермента ДНКполимеразы. Первая публикация по методу ПЦР появилась в ноябре 1985 года в журнале Science. А через восемь лет К.Муллис получил Нобелевскую премию за открытый им метод.

ЧТО такое ПЦР

Каждый живой организм имеет определенный набор специфичных, присущих только ему участков ДНК. Метод ПЦР позволяет найти в исследуемом материале среди огромного количества генетической информации именно такие специфичные участки и многократно их размножить.

Метод ПЦР основан на принципе естественной репликации ДНК, включающем расплетение двойной спирали ДНК, расхождение нитей ДНК и комплиментарное дополнение обеих. Репликация ДНК начинается только в определенных местах, где расположены стартовые блоки, а не в любой произвольной точке.

Суть метода заключается в том, что маркировав стартовыми блоками специфичные участки ДНК, характерные только для данного вида, можно многократно воспроизвести (амплифицировать) именно этот участок ДНК. В результате нарабатывается достаточное количество генетического материала для последующей детекции. Метод ПЦР настолько точен, что он позволяет не только выявлять наличие ДНК возбудителя в биологической пробе, но и точно установить его количество и генотипическую принадлежность.

КАК работает ПЦР

В отличие от амплификации ДНК в живых организмах, с помощью ПЦР можно амплифицировать относительно короткие участки ДНК, длиной не более 3000 пар оснований. Используя смеси различных полимераз, специальных катализаторов и соблюдая особые условия, исследователям удавалось амплифицировать с помощью ПЦР фрагменты ДНК длиной 20-40 тыс. пар оснований. Но это все равно ничтожно мало в сравнении с длиной хромосомной ДНК эукариотической клетки. Геном человека, например, состоит примерно из 3 млрд. пар оснований.

Для того, что бы провести анализ методом ПЦР, необходимо иметь в наличии короткие одноцепочечные участки ДНК, специфичные для данного вида возбудителя, называемые «праймерами».

Но специфичного участка длиной в несколько тысяч оснований вполне достаточно, что бы дифференцировать тип возбудителя.

Для проведения ПЦР вначале исследуемый материал нагревают до температуры денатурации, добиваясь того, что бы двухцепочечные молекулы ДНК исходного материала разделились на одиночные нити. Затем вносят праймеры. При внесении праймеров в раствор с исследуемым материалом, праймеры начинают «прочесывать» раствор в поисках участков, к которым они являются комплиментарными. Если такие участки найдены – то праймеры присоединяются к ним, образовав стартовые двухниточные участки.

После присоединения праймера (этот процесс называют «отжиг») начинается синтез маркированного специфического участка ДНК с помощью специфического фермента – Taq-полимеразы, который получают из термофильных бактерий.

Вновь синтезированные фрагменты ДНК становятся матрицами для синтеза новых участков ДНК в последующих циклах амплификации. Поэтому такая реакция и называется цепной. В результате 25 циклов амплификации из одного участка ДНК синтезируется 106 копий. А после 30-40 циклов нарабатывается достаточное количество ДНК, что бы визуально учитывать результаты реакции после электрофореза в агарозном геле.

КОМПОНЕНТЫ реакции ПЦР

Проведение анализа исследуемого материала методом ПЦР состоит из 3 этапов:

• Подготовка материала для ПЦР путем разделения и изоляции ДНК и РНК
• Собственно проведение полимеразной цепной реакции
• Детекция продукта ПЦР

Для проведения ПЦР необходимы следующие компоненты:

• ДНК-матрица, содержащая тот участок ДНК, который требуется амплифицировать.
• Два праймера, комплементарные противоположным концам разных цепей требуемого фрагмента ДНК.
• Термостабильная ДНК-полимераза – фермент, который катализирует реакцию полимеризации ДНК.

Полимераза для использования в ПЦР должна сохранять активность при высокой температуре длительное время, поэтому используют ферменты, выделенные из термофильных бактерий – Thermus aquaticus (Taqполимераза), Pyrococcus furiosus (Pfu-полимераза), Pyrococcus woesei (Pwo-полимераза) и другие.

• Дезоксирибонуклеозидтрифосфаты (dATP, dGTP, dCTP, dTTP).
• Ионы Mg2+, необходимые для работы полимеразы.
• Буферный раствор, обеспечивающий необходимые условия реакции — рН, ионную силу раствора.

Содержит соли, бычий сывороточный альбумин. Может быть использовано высококипящее минеральное масло (например, вазелиновое). Но это зависит от амплификатора, в котором проводится реакция. Если это амплификатор с подогреваемой крышкой, исключающий испарение реакционного раствора, то масло в пробирку не добавляется.

Также необязательным компонентом является пирофосфатаза. Этот фермент катализирует гидролиз побочного продукта реакции – пирофосфата, который может ингибировать полимеразную цепную реакцию.

ПРИМЕНЕНИЕ ПЦР

ПЦР – диагностика универсальна. Для проведения анализа методом ПЦР используется любой биологический материал, в котором может содержаться ДНК возбудителя – слизи, моча, кровь, мокрота, соскобы и биоптаты.

широкое распространение получил метод ПЦР для выявления инфекций, передаваемых половым путем, особенно скрытых или хронических. Это такие инфекции как хламидиоз, гарднереллез, микоплазменная инфекция и пр. Это возбудители, которых сложно выявить классическим способом выращивания клеток в лабораторных условиях. Да и анализ антител в серологическом растворе может быть неточным.

А исследовав соскоб эпителия уретры или канала шейки матки, секрет простаты или мочу, можно с точностью установить наличие именно той или иной инфекции, так как размножению подвергается только ДНК бактерии, а не сама бактерия.

Также метод ПЦР незаменим для диагностики вирусных заболеваний. Кроме выявления наличия вируса в пробе, ПЦР позволяет определять генотип вируса. Что очень важно, например, при выборе методов лечения папилломавируса человека и прогнозирования развития заболевания, т.к. вирусы ВПЧ, принадлежащие к разным типам, обладают различной патогенностью и онкогенностю.

Также генотипирование важно при диагностике вирусных гепатитов. Метод ПЦР используется для контроля за эффективностью лечения при вирусных гепатитах. Для этого производится так называемый «количественный» анализ, который позволяет не только выявить наличие вирусной ДНК, но и с точностью определить количество вирусов, содержащихся в крови.

Не стоит забывать и о диагностике ВИЧ-инфекции.

Метод ПЦР нашел свое применение в пульмонологии, где он используется для дифференциальной диагностики вирусных и бактериальных пневмоний, туберкулеза, дифтерии.

Метод может быть применен для выявления хеликобактериоза в гастроэнтерологии, для определения цитомегаловирусной инфекции и онковирусов.

Но выявление инфекционных заболеваний, оценка их вирулентности и устойчивости к антибиотикам – это только одна из возможностей ПЦРдиагностики. Она позволяет также проводить генетическую дактилоскопию, пренатальную диагностику и многое другое.

Современные методы пренатальной диагностики или скрининга носительства призваны помочь решить проблему детской смертности и инвалидности, связанной с развитием у детей наследственных болезней, наследственной предрасположенности к некоторым видам смертельных недугов (например, к раку). Именно ПЦР является тем методом, который позволяет выявить поврежденные участки ДНК, связанные с точечными мутациями генов, и влекущие страшные последствия.

Несмотря на то, что ПЦРдиагностика является высокоспецифичным методом, при ней также возможны ложно-положительные результаты, связанные с попаданием в материал исследования чужой ДНК и ее копий через предметы и реагенты. Предупреждается это правильной организацией исследования и соблюдением ряда правил.

ПРЕИМУЩЕСТВА

Метод ПЦР стал «золотым стандартом» при диагностике ряда заболеваний.

Главное преимущества метода – это его чувствительность. ПЦР позволяет выявить возбудителей в тех случаях, когда из за сверхмалого количества они недоступны для других методов.

Благодаря особенности ПЦР, позволяющей выявлять даже единичные экземпляры возбудителей в биологическом материале, метод особенно ценен в диагностике латентных и хронических форм заболеваний.

Возбудителей с высокой антигенной изменчивостью и внутриклеточных паразитов очень сложно обнаружить другими методами, а ПЦР дает такую возможность.

Также огромным достоинством метода является его быстрота, т.к весь процесс, начиная с выделения вирусной или бактериальной ДНК из пробы, занимает всего несколько часов.

В то время, как трудоемкий метод выращивания визуализируемых колоний возбудителя в лабораторных условиях может занимать несколько дней. Практически полная автоматизация метода сводит к минимуму вероятность ошибок, связанных с ручной подготовкой и тестированием проб.

Метод эффективен при диагностике трудно культивируемых, некультивируемых и персистирующих форм патогенных бактерий.

Также метод может быть использован для тестирования объектов внешней среды.

Специфичность метода составляет 100%.

Метод используется не только в диагностике, но и в наблюдении за динамикой течения заболеваний, т.к. позволяет определять число копий возбудителя в пробе и, тем самым, контролировать виремию или бактеремию в процессе лечения. Что позволяет своевременно оценить эффективность лечения и произвести необходимые корректировки.

Очень важно, что при проведении исследования методом ПЦР практически исключается возможность инфицирования персонала во время проведения анализа, т.к. исследуемый материал может быть дезинфицирован химически или термически в момент забора.