Когда клетки становятся достаточно многочисленными, их переносят в лунки объемом 1—2 мл. Для этого за 2 дня до переноса гибридом в планшеты для культивирования (например, Linbro с 24 лунками) вносят ядросодержащие сингенные клетки селезенки (по 5х10 5 клеток в лунку). Гибридомы аккуратно суспендируют при помощи движений поршня пипетки и переносят по 100 мкл из каждой исходной лунки в 2 лунки объемом 1 мл. .Начиная с 5-й недели после слияния, трижды производят замену среды (ГТ, а не ГАТ). В дальнейшем можно вести культивацию в обычной культуральной среде.
В лунках объемом 2 мл гибридомы так разрастаются, что их переносят в планшеты с четырьмя лунками по 5 мл. Стабильные гибридомы можно переносить в культуральные сосуды по 25—50 мл. На этой стадии можно заменять сыворотку плода коровы нормальной сывороткой коров или лошадей. В этих сосудах среду следует также менять каждые 3—4 дня. На этом этапе можно получить достаточное количество клеток для культивирования in vivo на сингенных мышах.
ИЗУЧЕНИЕ СВОЙСТВ ОНКОЛИТИЧЕСКОГО ВИРУСА ОСПОВАКЦИНЫ IN VITRO И IN VIVO — ФБУН «Вектор»
Отбираемые при смене среды моноклональные антитела можно использовать для характеристики специфичности и молекулярных особенностей иммуноглобулин. В среднем концентрация моноклональных антител в культуральной среде составляет 10—50 мкг/мл.
Культивирование гибридом in vivo
Сингенным мышам предварительно вводят внутрибрюшинно 0,5 мл полужидкого парафина (DAB 7, VEB Leunawerke, Merseburg) или пристана (Koch-Light Lobs). Через 1—4 недели после предварительной обработки внутрибрюшинно вводят по 2х10 7 гибридных клеток каждому животному. В асцитической жидкости мышей концентрация моноклональных антител может достигать 5—10 мг/мл. Содержащиеся в асцитической жидкости гибридомы можно перевивать другим мышам после предварительной обработки (см. выше).
Источник: www.fresh25.ru
Биология и медицина
Извлеченным из организма клеткам можно создать такие условия, при которых они будут жить и размножаться в искусственной среде (in vitro — вне организма, в отличие от in vivo — в организме), образуя культуру клеток. Клеточные культуры можно получать из таких клеток, которые в составе организма потеряли способность к делению, например из лейкоцитов периферической крови.
Изучение поведения клеток в культуре помогает понять механизмы контроля деления клеток. Установлено, что в этом контроле главную роль играют клеточные взаимодействия. Наблюдение за клеточными культурами показало, что клетки активно делятся и расползаются по стеклу сосуда, в котором их культивируют до тех пор, пока они не начнут соприкасаться друг с другом.
Контакт поверхностей соседних клеток приводит к остановке их движения и одновременно выключает клетки из размножения. Когда клетки плотным слоем покроют всю доступную им поверхность сосуда, деления прекратятся.
Некоторое время клетки будут жить, потом в них начнут возникать всевозможные нарушения, и если часть клеток не пересадить в другой сосуд, на новую среду, то культура погибнет. Интересно, что пересев клеток на новую среду не всегда стимулирует клеточное размножение. Клетки, претерпевшие несколько пересевов, со временем не приступают к делению даже на новой среде.
In vivo vs. in vitro drug development
Специальные эксперименты показали, что клетки, взятые из тканей взрослых организмов, способны делиться in vitro меньшее число раз, чем клетки, полученные из эмбрионов. Причину этого явления, названного по имени открывшего его ученого феноменом Хейфлика , многие исследователи видят в старении клеток, и в настоящее время клеточные культуры служат объектом изучения механизмов старения на клеточном уровне.
Клетки, взятые из раковых опухолей, ведут себя в культуре немного иначе. Контакт поверхностей клеток не останавливает их делений, они продолжают размножаться и культура становится многослойной. Не подчиняются опухолевые клетки и правилу Хейфлика: они могут претерпевать неограниченное число делений.
Некоторые клетки в культуре остаются дифференцированными: синтезируют специфические белки, сохраняют морфологические особенности, например опухолевые клетки лимфоидного происхождения. Другие клетки при переносе их в искусственные условия становятся недифференцированными.
Изменение условий выращивания иногда приводит к потере, иногда к приобретению свойств дифференцированных клеток. Это позволяет использовать клетки в культуре для изучения механизмов клеточной дифференцировки.
Сохранение некоторыми клетками in vitro дифференцированного состояния послужило толчком для создания клеточных культур с практическими целями для получения из них веществ, которые синтезируются этими клетками. Так получают антитела к различным белкам. Можно получать и лекарственные вещества из клеток тех растений, которые плохо выращиваются на плантациях.
Клеточные культуры нашли применение и в медицине. Для диагностики наследственных заболеваний иногда необходимо достаточно большое количество клеток организма для того, чтобы можно было провести биохимический анализ. Если диагноз нужно установить у эмбриона человека, то взятие материала на анализ представляет большую проблему. В этом случае на помощь приходит техника клеточных культур: несколько сотен клеток, взятых из ворсинок оболочки зародыша без вреда для него, достаточно, чтобы вырастить большую клеточную массу. Клеточные культуры используют и в вирусологии — для выращивания вирусов и изучения их свойств, а также в фармацевтической и химической промышленностях для исследования повреждающего действия на ДНК и хромосомы вновь синтезированных химических веществ.
Ссылки:
Источник: medbiol.ru
Клеточные тест-системы in vitro
– это гомогенная
популяция
генетически
однородных клеток,
растущих в
постоянных условиях
Получение – путем стерильного удаления фрагмента ткани и его дезагрегации:
Механически ткань измельчают до кусочков объемом 1 мм3, которые
прикрепляются к субстрату благодаря собственной адгезивности, наличию
насечек на чашке или с помощью сгустка плазмы. Клетки, мигрирующие из
эксплантатов, используются для пассирования.
Дезагрегация ферментами: трипсином (0,25% неочищенный или 0,01–0,05 %
очищенный) или коллагеназой (200–2000 ЕД/мл, неочищенная). Клетки
образующейся суспензии оседают, прикрепляются к поверхности и
распластываются на ней. Способ обеспечивает более высокий выход клеток.
5. Характеристика клеток, культивируемых in vitro
По виду животного
По способу выращивания:
По состоянию ткани на
момент извлечения:
монослойные
По типу ткани-источника:
нормальные
суспензионные
соединительная – фибробласты
опухолевые
на микроносителях
скелетная – кость и хрящи
мышечная – скелетные,
По количеству субкультивирований и сроку
сердечные и гладкие мышцы
жизни:
эпителиальная – печень, легкие,
первичные культуры – получены
кожа, мочевой пузырь, почки,
непосредственно от организма и растут до
молочная железа
первого субкультивирования
нервная – глиальные клетки и
клеточные линии:
нейроны (хотя они лишены
• диплоидные культуры –75% клеток обладает
способности к пролиферации)
кариотипом нормальных клеток исходного
эндокринная система – гипофиз,
вида
надпочечники, клетки островков
• постоянные (перевиваемые, непрерывные)
Лангерганса
гетероплоидные культуры, существующие вне
организма десятки лет
6. Системы культивирования клеток
Основные системы культивирования клеток.
1. Непроточные культуры — тип культур, в
котором клетки вводят в фиксированный
объем среды, при истощении которой
происходит прекращение пролиферации
клеток. Способы увеличения
продолжительность жизни непроточных
культур:
прерывистый
постоянный
перфузионный, открытый и закрытый.
2. Проточные культуры — без изменения
концентрации питательных веществ и
метаболитов, а также числа клеток. Гомеостаз
обусловлен постоянным вхождением среды в
культуру и одновременным удалением равного
объема среды с клетками.
первичная
монослойный
на
микроносителях
культура клеток
перевиваемая
монослойный
суспензионный
диплоидная
монослойный
на
микроносителях
7. Монослойный способ
Большинство нетрансформированных клеток
млекопитающих могут расти in vivo и in vitro только
будучи прикрепленными к субстрату:
стеклу (алюмоборосиликатное стекло,
чаще модифицированное)
пластику (обработанные полистирол,
полиэтилен, поликарбонат,
поливинилхлорид, тефлон, целлофан и др.)
металлу (нержавеющая сталь или титан)
другим клеткам
8. Выбор клеточных тест-систем
Монослой клеточных линий при 10×увеличении
HEK 293, человек,
клетки почки
эмбриона
VERO, африканская
зеленая мартышка,
почка
NCTC, мышь C3H/An,
подкожная
соединительная ткань
9. Питательные среды и добавки
Стандартные среды для
ведения культур
животных клеток:
среды Игла MEM
(minimal essential
medium) и BME (basal
medium, Eagle)
среда Дульбекко DME
или DMEM (двойная
модификация среды
Игла)
среда Искова IMDM –
модификация среда
Дульбекко
среда МакКоя 5А и
серия сред RPMI
среда 199
5–20% биологических
жидкостей, например,
фетальной (эмбриональной)
бычьей сыворотки, сыворотки
крови жеребцов или телят для
обеспечения клеток:
гормонами
(кортикостероиды, инсулин,
простагландины)
ростовыми факторами
(эмбриональным,
фибробластным,
тромбоцитрным,
опухоленекротическим)
факторами прикрепления и
распластывания клеток
(коллаген, фибронектин,
ламинин)
транспортными белками
(альбумин, трансферрин)
Антибиотики
для
уничтожения
микрофлоры:
пенициллин
(100 ЕД/мл),
стрептомицин
(50 ЕД/мл),
тетрациклин
(100 ЕД/мл)
10. Состав питательных сред для клеточных тест-систем
11. Биотестирование — определение степени безопасности объектов по реакции живых организмов
ракообразные
простейшие
позвоночные
тесторганизмы
водоросли
культуры клеток и
тканей
моллюски
семена растений
12. Способ определения безопасности пищевых ингредиентов с помощью клеточных тест-систем
На основе исследований клеточных систем in vitro
был получен патент «Способ определения
безопасности пищевых ингредиентов с помощью
клеточных тест-систем» авторы Чеботарёв И.И.,
Никонов И.Н., Машенцева Н.Г., Чеботарёва С.Е.,
Фисинин В.И., Клабукова Д.Л.
Источник: ppt-online.org