Парадокс современных исследований: с одной стороны со всех сторон требуют ограничить эксперименты на животных и где только возможно заменить их экспериментами на изолированных клеточных культурах («ex vivo») или вообще in vitro («в пробирке»). А с другой стороны — ни один хороший журнал не приймет к публикации статью, большая часть которой не сделана на трансгенных мышах.
Comments:
Даже на мышах иногда маловато для перехода к клиническим испытаниям. Вообще, кажется, пора организовывать общество защиты прав человека от защитников прав животных. Эти ребята готовы на себе испытывать все, что в пробирке оказалось для пробирки безвредным? Стали ортодоксальными вегетарианцами? Трындеть, знаете ли, не работать .
Я — не физиолог или фармаколог (вот им мышами не ограничится) и занимаюсь сосудистой биологией и лейкоцитарными рецепторами, мышей мне для работы как правило хватает.
Раньше я выделял белки, показывал, что они взаимодействуют (или не взаимодействуют) друг с другом или с клеткой — и этого вполне хватало для хорошей публикации. А теперь требуется, чтоб я еще вдобавок сделал трансгенных мышей — вырубил у них эти белки и показал, к чему это приводит. Я не жалуюсь — это нормальное и логичное требование к исследованиям.
In Vitro In Vivo (IVIV) Correlations
А вот то, что на бюрократию, получение разрешений для работы чуть ли не над каждым мышом мне с каждым годом приходится тратить все больше времени и усилий — это уже предел! Получить разрешение на иммунизацию мыша — это уже целая пытка, в тебе заранее, априори, подозревают доктора Менгеле. Стандартный и общеприинятый метод выращивания большого количества моноклональных антител — впрыснуть мышке в перитонеум сделанные тобой гибридомы (производные лимфоцитов, синтезируют только один вид конкретных антител), через пару недель там образуется асцит (род опухоли), содержащий до 100 мг антител. Асциты с 2-3 мышей — и антител хватит на год работы. ЗАПРЕЩЕНО!
Вы совершенно правы — уже давно пора обществу защищатся от «защитников животных». Вы представляете — в комиссиях, выдающих разрешения на эксперименты с позвоночными животными (IACUC) всегда присутствует whistleblower из организации подобных овощей и решает, можно ли мне использовать мышей и сколько.
Что там, — «на себе не испытывать» или травку есть, черт с ними, нужны они . но вот заболей они — так от общества же они и потребуют нормального лечения.
Человек — существо вредное для природы, противоестественное. Постоянно чего-то расходует и выделяет. А природа, атмосфера и космос от этого страдают. Коровы пукают и рыгают, выделяют метан, лес тоже вредный — выделяет. Человек отравляет окружающую среды, сам напихан ядохимикатами, мешает природе развиваться и — вообще!
Гнать его с Земли к чёрту на кулички!
Хотя ведь и там будет отравлять.
Строго говоря, любой биологический вид меняет окружающую среду. Обвинять человека в том, что он что-то расходует и выделяет это примерно то же самое, что и обвинять волков, что они вырезали стадо овец. Человек просто находится выше в пищевой цепи.
In Vivo vs. In Vitro: What Does It All Mean? | Tita TV
К тому же, в отличие от волка, человек хоть иногда, но заботится о возобновлении некоторых своих пищевых (и не только) ресурсов.
М.б., я безнадёжно испорчен, но эти ребята за свои деньги будут биться не щадя живота — причём, с теми только, кто платит. С производителями и продавцами мышеловок не будут — те свои деньги не отдадут, а учёные за разрешение отдадут — потому что ведь не свои, да ведь чудаки — и свои отдадут . Кругами по воде от этих защитников — те, кому надо чем-то себя занять и/или стать «важными», ну, и просто не очень здоровые, набивающие в свою 1-комнатную хрущёвку 50-60 бездомных собак, из-за которых соседи не могут ни спать, ни дышать, ни за дверь выйти. Но даже это круги по воде, а камень — деньги . Циник я, но когда в своё время союзное ведомство запретило использование метадона в наркологии для вывода наркоманов из «ломки», у меня был только один вопрос: кто в этом ведомстве и сколько получил на лапу за уход метадона на чёрный рынок, где он стоил ого-го сколько. Хотя тоже вроде как наркоманов защищали от подсаживания на метадон . очень «эффективно» — они мёрли, как мухи, в ломке. И очень мало вероятно, что все эти деньговороты можно будет остановить .
Все совершенно правильно и никакой это не цинизм. Это «движение» целиком состоит из молодых недоумков, старых сентиментальных маразматиков и законченных циничных интриганов любого возраста, делающих так себе политическую карьеру.
Кто больше всего кричит о «вреде трансгенных продуктов (ГМО)»? Бездарные несостоявшиеся ученые, ни на что не способные и видящие единственную возможность «себя показать» — только в роли «борцов за счастье народа», по образцу незабвенного Трофима Денисовича. Плюс — чисто шкурные интересы производителей с/х антибиотиков, гормональных препаратов, удобрений, пестицидов, гербицидов, дефолиантов и прочей реальной отравы.
. но самое интересное состоит в том, с одной стороны, что границы между «ими» и «нами» предельно размыты, а с другой, что они понимают, что мы понимаем, что, хотя мы и понимаем всю слабость их оснований, поделать с ними мы ничего не можем и в силу «с одной стороны», и вообще . 🙂
Как бы не были эти границы размыты из-за вполне присущих и нам шкурных интересов, они тем не менее существуют. Ни вы, ни я не способны заведомо лгать по принципиальным вопросам (в мелочах — вполне) и зарабатывать себе на хлеб с маслом заведомой для нас ложью.
А сделать с ними, действительно, мало что можно. 🙂 Любая поппытка будет похожа на спор атеиста с верующим: я говорю — докажи, что Бог есть, а он — нет, это ты докажи, что Бога нет. 🙂
Наверное единственный выход,это научить мышек писать о своем согласии на проведение опытов над ними в присутствии нотариуса.:)
Источник: old-surehand.livejournal.com
In vitro
Латинский термин, означающий за пределами естественной биологической среды Клонированные растения in vitro
In vitro ( значение: в стекле) исследования проводятся с микроорганизмами, клетками или биологическими молекулами вне их нормального биологического контекста. В просторечии называемые «эксперименты в пробирке », эти исследования в биологии и ее разделах традиционно проводятся в лабораторном оборудовании, таком как пробирки, колбы, чашки Петри и микротитрационные планшеты. Исследования, проводимые с использованием компонентов организма, которые были изолированы от их обычного биологического окружения, позволяют провести более подробный или более удобный анализ, чем можно провести с целыми организмами; однако результаты, полученные в экспериментах in vitro, могут не полностью или точно предсказать воздействие на весь организм. В отличие от экспериментов in vitro, исследования in vivo проводятся на живых организмах, включая человека, и на целых растениях.
Определение
In vitro (латинское : в стекле; часто не выделено курсивом на английском языке) исследования проводятся с использованием компонентов организма, которые были изолированы от их обычного биологического окружения, таких как микроорганизмы, клетки или биологические молекулы. Например, микроорганизмы или клетки можно изучать в искусственных питательных средах, а белки можно исследовать в растворах. Эти исследования в биологии, медицине и их дисциплинах, в просторечии называемые «экспериментами в пробирках», традиционно проводятся в пробирках, колбах, чашках Петри и т. Д. В настоящее время они включают весь спектр методов, используемых в молекулярной биологии, таких как omics.
Напротив, исследования, проводимые на живых существах (микроорганизмах, животных, людях или целых растениях), называются in vivo.
Примеры
Примеры исследований in vitro включают: выделение, рост и идентификацию клеток, полученных из многоклеточных организмов (в клетке или культура ткани ); субклеточные компоненты (например, митохондрии или рибосомы ); клеточные или субклеточные экстракты (например, экстракты зародышей пшеницы или ретикулоцитов ); очищенные молекулы (такие как белки, ДНК или РНК ); и коммерческое производство антибиотиков и других фармацевтических продуктов. Вирусы, которые размножаются только в живых клетках, изучаются в лаборатории на клеточной или тканевой культуре, и многие вирусологи животных называют такую работу in vitro, чтобы отличить ее от работы in vivo на целых животных.
- Полимеразная цепная реакция — это метод селективной репликации определенных последовательностей ДНК и РНК в пробирке.
- Очистка белка включает выделение конкретного представляющего интерес белка из сложной смеси белков, часто получают из гомогенизированных клеток или тканей.
- Оплодотворение in vitro используется для того, чтобы сперматозоиды оплодотворяли яйцеклетки в культуральной чашке перед имплантацией полученного эмбриона или эмбрионов в матку будущей матери.
- Диагностика in vitro. относится к широкому спектру медицинских и ветеринарных лабораторных тестов, которые используются для диагностики заболеваний и мониторинга клинического состояния пациентов с использованием образцов крови, клеток или других тканей, полученных от пациента.
- In vitro тестирование использовалось для характеристики конкретных процессов адсорбции, распределения, метаболизма и выведения лекарств или общих химических веществ внутри живого организма; например, эксперименты с клетками Caco-2 могут быть выполнены для оценки абсорбции соединений через слизистую оболочку желудочно-кишечного тракта; Распределение соединений между органами может быть определено для изучения механизмов распределения; Суспензии или посевные культуры первичных гепатоцитов или гепатоцитоподобных клеточных линий (HepG2, HepaRG) можно использовать для изучения и количественной оценки метаболизма химических веществ. Эти параметры процесса ADME затем могут быть интегрированы в так называемые «физиологические фармакокинетические модели» или PBPK.
Преимущества
Исследования in vitro позволяют проводить видоспецифичный, более простой, удобный и более подробный анализ. чем нельзя сделать со всем организмом. Подобно тому, как исследования на целых животных все больше и больше заменяют исследования на людях, исследования in vitro заменяют исследования на целых животных.
Простота
Живые организмы — чрезвычайно сложные функциональные системы, состоящие как минимум из многих десятков тысяч генов, белковых молекул, молекул РНК, небольших органических соединений, неорганических ионов, и комплексы в среде, которая пространственно организована мембранами, а в случае многоклеточных организмов — системами органов. Эти бесчисленные компоненты взаимодействуют друг с другом и с окружающей средой таким образом, что обрабатывает пищу, удаляет отходы, перемещает компоненты в нужное место и реагирует на сигнальные молекулы, другие организмы, свет, звук, тепло, вкус, прикосновение и баланс..
Вид сверху «курительного робота» модуля воздействия на млекопитающих Vitrocell, (крышка снята) вид четырех отдельных лунок для вкладышей клеточных культур, которые будут подвергаться воздействию табачного дыма или аэрозоля для исследования in vitro эффекты
Эта сложность затрудняет идентификацию взаимодействий между отдельными компонентами и исследование их основных биологических функций. Работа in vitro упрощает изучаемую систему, поэтому исследователь может сосредоточиться на небольшом количестве компонентов.
Например, идентичность белков иммунной системы (например, антител) и механизм, с помощью которого они распознают и связывание с чужеродными антигенами оставалось бы очень неясным, если бы не широкое использование работы in vitro для выделения белков, идентификации клеток и генов, которые их продуцируют, изучения физических свойств их взаимодействия с антигенами и определения того, как эти взаимодействия приводят к клеточные сигналы, которые активируют другие компоненты иммунной системы.
Видовая специфичность
Еще одно преимущество методов in vitro состоит в том, что клетки человека можно изучать без «экстраполяции» клеточного ответа экспериментального животного.
Удобство, автоматизация
Методы in vitro можно миниатюризировать и автоматизировать, что дает высокопроизводительные методы скрининга для тестирования молекул в фармакологии или токсикологии.
Недостатки
Основным недостатком экспериментальных исследований in vitro является то, что они могут трудно экстраполировать результаты работы in vitro на биологию интактного организма. Исследователи, выполняющие работы in vitro, должны проявлять осторожность, чтобы избежать чрезмерной интерпретации своих результатов, которая может привести к ошибочным выводам об организменной и системной биологии.
Например, ученые, разрабатывающие новое вирусное лекарство для лечения инфекции, вызванной патогенный вирус (например, ВИЧ-1) может обнаружить, что лекарство-кандидат функционирует для предотвращения репликации вируса в условиях in vitro (обычно в культуре клеток). Однако до того, как это лекарство будет использовано в клинике, его необходимо пройти через серию испытаний in vivo, чтобы определить, является ли он безопасным и эффективным для интактных организмов (обычно мелких животных, приматов и людей последовательно). Как правило, большинство лекарственных препаратов-кандидатов, эффективных in vitro, оказываются неэффективными in vivo из-за проблем, связанных с доставкой препарата к пораженным тканям, токсичности по отношению к основным частям организма, которые не были представлены в первоначальных исследованиях in vitro, или по другим причинам.
Экстраполяция in vitro на in vivo
Результаты, полученные в экспериментах in vitro, обычно не могут быть перенесены, как есть, для прогнозирования реакции всего организма in vivo. Поэтому создание последовательной и надежной процедуры экстраполяции результатов in vitro на in vivo чрезвычайно важно. Решения включают:
- Повышение сложности систем in vitro для воспроизведения тканей и взаимодействия между ними (как в системах «человек на чипе»)
- Использование математического моделирования для численного моделирования поведения сложной системы, где данные in vitro предоставляют значения параметров модели
Эти два подхода не являются несовместимыми; более совершенные системы in vitro предоставляют более точные данные для математических моделей. Однако все более сложные эксперименты in vitro собирают все более многочисленные, сложные и сложные данные для интеграции. Здесь очень нужны математические модели, такие как модели системной биологии.
Экстраполяция в фармакологии
В фармакологии IVIVE можно использовать для приближения фармакокинетики (PK) или фармакодинамика (PD). Поскольку время и интенсивность воздействия на заданную мишень зависят от зависимости от времени концентрации лекарственного средства-кандидата (исходной молекулы или метаболитов) в этом целевом участке, чувствительность тканей и органов in vivo может быть совершенно иной или даже обратной по сравнению с наблюдаемой на культивируемых клетках. и экспонировались in vitro. Это указывает на то, что экстраполяционные эффекты, наблюдаемые in vitro, нуждаются в количественной модели PK in vivo. Физиологические модели PK (PBPK ) обычно считаются центральными для экстраполяций.
В случае ранних эффектов или тех, которые не имеют межклеточной коммуникации, одна и та же концентрация клеточного воздействия считается причиной одинаковые эффекты, как качественно, так и количественно, in vitro и in vivo. В этих условиях недостаточно разработать простую модель PD зависимости доза-ответ, наблюдаемую in vitro, и перенести ее без изменений для прогнозирования эффектов in vivo.
См. Также
- Испытания на животных
- Ex vivo
- In situ
- In utero
- In vivo
- In silico
- In papyro
- In natura
- Клеточные in vitro на животных и биология развития
- Клеточная биология и биология развития in vitro
- Токсикология in vitro
- Экстраполяция in vitro на in vivo
- Подготовка срезов
Ссылки
Внешние ссылки
| Искать in vitro в Викисловаре, бесплатный словарь. |
- Средства массовой информации, относящиеся к In vitro в Wikimedia Commons
Источник: alphapedia.ru
Актуальные проблемы доклинических исследований: переход к альтернативной in vitro-токсикологии
Г.Н. ГИЛЬДЕЕВА, к.б.н., доцент кафедры организации и управления в сфере обращения лекарственных средств ГБОУВПО «Первый Московский государственный медицинский университет им. И.М. Сеченова» Минздрава России
В статье рассмотрены принципы и основы альтернативной in vitro-токсикологии. Обсуждаются преимущества и недостатки токсикологических тест-систем in vivo и in vitro. Изложена современная парадигма токсикологических исследований in vitro, стратегия их осуществления, а также кратко описаны некоторые альтернативные методические подходы, использующиеся в доклинических исследованиях.
Проблемы этического, разумного и экономного использования лабораторных животных в современных доклинических исследованиях лекарственных препаратов привлекают большое внимание специалистов и общественности. Безусловно, эксперименты на животных крайне важны для сохранения здоровья человека, однако эти исследования являются трудоемкими и дорогостоящими, а также они травмируют подопытных животных и приводят к их гибели. Поэтому сегодня вполне обоснованы усилия ученых, направленные на максимальное сокращение количества животных и замену их альтернативными моделями и тест-системами в условиях in vitro. Современные методы позволяют не только свести количество подопытных животных к минимуму, но и полностью или частично заменить их. Такие методы помогают помимо решения этических проблем, связанных с массовым использованием и гибелью экспериментальных животных, значительно удешевить и сократить сроки предварительного исследования новых лекарственных препаратов, прежде всего на стадии их доклинических исследований [1, 5].
В настоящее время все большее внимание уделяется концепции усовершенствования, уменьшения и замены (Refinement, Reduction, and Replacement), которая также известна как «Три R», а методы, использующие эту концепцию, называются альтернативными [6, 14]. В данной концепции Refinement (усовершенствование) включает методы, исключающие или вызывающие минимальную боль, страдания и стресс у животных.
Reduction (сокращение) включает методические подходы, позволяющие получать информацию при использовании меньшего числа животных или получения большего количества данных на том же количестве животных. Replacement (замена) означает замену на методы, позволяющие достичь цели без проведения экспериментов на животных. За последние 50 лет концепция «трех R» получила выражение в законах, стандартах и руководящих документах во всем мире. Сегодня концепция «трех R» является самой передовой в области научных исследований. Благодаря этой концепции удалось сконцентрировать на данной проблеме внимание правительств и академических центров, что привело к существенному изменению техники исследований, испытаний и обучения с пользой как для науки, так и в интересах защиты экспериментальных животных [2].
Всемирная организация здравоохранения, международное медико-биологическое общество не только одобряют, но и настоятельно рекомендуют и поддерживают использование альтернативных моделей и методов в токсикологии. Использование in vitro-тестов при оценке безопасности, разработке лекарств и новых продуктов уже стало общепринятым.
Согласно принципам правительства США по использованию животных в научных исследованиях, тестировании и образовании и политике Министерства здравоохранения США по гуманному обращению и использованию лабораторных животных, до проведения тестирования на животных должны использоваться in vitro тест-методы определения базальной цитотоксичности, где это приемлемо [12]. Такие методы считаются частью взвешенного подхода для оценки начальной дозы при исследовании острой пероральной токсичности препаратов in vivo. Для некоторых исследуемых препаратов подобный подход уменьшает число используемых животных, а также долю животных, которые погибают или умерщвляются в процессе эксперимента. Многие крупные международные компании уже широко используют альтернативные методы.
В 2007 г. Национальный научный совет США (NRC) опубликовал доклад о будущем токсикологических исследований, в котором говорится, что настало время разработки новой парадигмы, не основанной на использовании животных. Основное предложение доклада заключалось в переориентации тестирования на молекулярный уровень вместо наблюдения фенотипических реакций целого организма, переходе от тестирования на целом животном на тестирование на клеточном уровне [9].
У таких предложений есть серьезные основания, поскольку несовершенство и ограничения тестирования на животных очевидны и понятны. Традиционная токсикология in vivо трудоемка, она требует много времени и расхода большого количества тестируемого продукта. Тестирование на животных трудно адаптировать к современному направлению высокопроизводительных скрининговых технологий, что в конечном счете создает препятствия на пути массового скрининга лекарственных препаратов и химических веществ.
Использование новейших научных инструментов для доказательства безопасности и эффективности новых продуктов в кратчайшие сроки, с большей надежностью и меньшими расходами является насущной необходимостью. Клетки in vitro являются средством, обеспечивающим дальнейшее развитие в этом направлении.
В настоящее время возможно культивировать широкий спектр клеток различных типов, в т. ч. из разных тканей и видов. Это очень удобно, т. к. создаются условия для определения орган- и видоспецифичной токсичности. Если же используются клетки человека, то минимизируются проблемы межвидовой экстраполяции [13]. Другими словами, преимущества тестов in vitro заключаются в том, что они быстры, недороги и позволяют исследовать специфические механизмы действия исследуемых агентов.
Еще одно преимущество моделей in vitro заключается в возможности работы непосредственно на культурах клеток человека, что делает полученные данные более адекватными при их проекции на организм человека. Кроме того, использование культур клеток позволяет установить характер биологической активности изучаемых соединений непосредственно на клеточном уровне и учесть сложные синергические и/или разнонаправленные эффекты смесей химических соединений.
Крупный вклад в развитие нового направления — клеточной токсикологии внес выдающийся шведский ученый Бъерн Икволл (Bjorn Ekwall). Сформулированная им в 1983 г. концепция т. н. базовой цитотоксичности лежит в основе использования тестов на культуре клеток для определения острой токсичности химических веществ вместо тестов на животных. Чтобы на практике проверить свои теории, был организован международный токсикологический проект под названием Multicentre Evaluation of In Vitro Cytotoxicity Programm (MEIC), в котором 50 отобранных химических веществ тестировались в 100 лабораториях во всем мире, причем было применено более 60 различных тестов in vitro. Результаты проекта MEIC наглядно продемонстрировали возможность использования тестов in vitro для прогнозирования токсических концентраций химических веществ в организме человека [7].
В ходе работы над этим проектом было выделено 3 типа токсичности:
• Базовая (общая) цитотоксичность — неблагоприятное воздействие химических веществ на общие для всех клеток структуру и функции, необходимые для выживания клетки, деления, репликации ДНК и т. д.
• Органоспецифическая цитотоксичность — влияние на структуры и функции, специфические для определенных клеток тканей и органов.
• Внеклеточная токсичность — проявляется, если ксенобиотик непосредственно не влияет на клетку, но его действие критическое на уровне целостного организма и охватывает процессы, происходящие вне клеток (например, клеточная секреция).
Автор указывал, что все три типа цитотоксичности могут иметь место in vivo, поэтому должны учитываться в стратегии исследований in vitro [8].
Исследования токсичности лекарственных препаратов in vitro проводят на первичных культурах клеток и тканей, выделенных из организма животных, человека, а также перевиваемых или постоянных, полученных из отдельных видов опухолей. К первичным культурам клеток человека относятся гепатоциты, эпителиоциты, кератиноциты, хондроциты.
Первичные культуры клеток животных представлены гепатоцитами, клетками крови. Также для оценки токсичности используют постоянные клеточные линии человека: клетки немелкоклеточного рака легких — А-549, нейробластомы NB-1, эпителиальные клетки синовиальной жидкости — McCoy и др. Среди постоянных клеточных линий животных в токсикологических исследованиях используют: фибробласты мышей — L929, BALB 3T3; клетки гепатомы крыс — HTC; клетки опухоли Эрлиха мышей и др. Из специализированных клеток можно выделить эритроциты периферической крови мышей BALB/c, сперматозоиды быка, мышечные клетки крысы. Исследование на различных клеточных линиях предоставляет четкую информацию о потенциальных эффектах лекарственных препаратов и их специфическом действии [11].
В настоящее время исследования общей и специфической токсичности потенциальных тератогенов наиболее эффективно проводятся с применением полипотентных стволовых клеток эмбрионов человека, которые способны к дифференциации in vitro с образованием миокардиальных, мышечных, эндотелиальных клеток, гепатоцитов [3].
При оценке тканевой токсичности используют срезы тканей и реконструированные модели, которые имитируют нормальные ткани in vitro [3]. Такие модели позволяют проводить такие испытания, как исследование раздражающего действия лекарственных препаратов, исследование фототоксичности, исследование абсорбции вещества через кожу и ее барьерной функции и др. На сегодня известны коммерческие органотипичные и реконструированные модели эпидермиса, такие как EPISKIN, EpiDerm, Full Thickness. На указанных моделях были выполнены опыты с изучением повреждающего действия большого количества химических веществ. Эти модели стандартизированы, зарегистрированы и внесены Европейской организацией экономического сотрудничества и развития (OECD) в лист инструкций по тестированию токсичности химических веществ, а также в новое Европейское законодательство REACH [4].
Одним из самых сложных направлений в создании альтернативных моделей изучения токсичности является разработка моделей барьерных систем организма [10]. В этом направлении наиболее весомые успехи достигнуты в воспроизведении эпителиального барьера, который является первым препятствием на пути проникновения ксенобиотика в организм.
Для исследований интерстициального барьера наибольшее развитие получили модели процессов абсорбции с использованием клеточных линий НТ-29 и Сасо-2. Относительно гематоэнцефалического барьера, что является важным для многих токсичных веществ, то в этом направлении разрабатываются трехмерные модели, содержащие глиальные и эндотелиальные клетки. Были созданы органотипичные модели: модель глаза для изучения раздражающего действия в замену теста Драйзера на кроликах [15]. Система клеточных культур, аналогичная головному мозгу, разработана для тестирования нейротоксичности [3]. Проведенные исследования показали, что реконструированные модели, имитирующие нормальные ткани in vitro, имеют хорошую корреляцию с системным токсическим действием, определяемым у животных.
Таким образом, исследования с использованием клеточных культур позволяют проводить сравнительную экспресс-оценку токсичности и опасности химического вещества, исследование нарушения обмена веществ в клетке, изучение цито- и органотоксичности, мутагенных и канцерогенных эффектов. Для исследования цитотоксичности ксенобиотиков на культуре клеток рекомендованы следующие тесты: 1) определение количества жизнеспособных клеток с использованием трипанового синего; 2) определение содержания общего белка как показателя прироста клеточной массы, который также может быть показателем клеточной пролиферации; 3) определение изменений активности дыхательных ферментов в тесте с метилтетразолием (МТТ); 4) оценка лизосомальной активности и интенсивности процессов активного мембранного переноса — по поглощению красителя нейтрального красного; 5) оценка степени повреждения цитоплазматической мембраны — по выходу в среду инкубации фермента лактатдегидрогеназы (ЛДГ).
Кроме вышеперечисленных методов, довольно часто применяются такие тесты, как определение нарушения регуляции ионного состава, оценка нарушения процессов метаболизма, определение содержания аденозинтрифосфата (АТФ) в клетках и инкубационной среде, оценка морфологических изменений клеток.
Для изучения органотоксичности используют тесты, что и при определении общей токсичности, а также специфические маркеры: ферменты аланинаминотрансфераза (АЛТ) и аспартатаминотрансфераза (АСТ) — для клеток печени; ЛДГ и тропонин — для клеток сердечной ткани; для фибробластов кожи — скорость синтеза коллагена; для иммунотоксичности — синтез интерлейкинов и антител, уровень С-реактивного белка. Кроме того, для всех типов клеток можно провести ПЦР (полимеразная цепная реакция) диагностику с целью определения активации того или иного гена, отвечающего за синтез белка, фермента, кофактора. По результатам вышеуказанных тестов определяют такие параметры, как IC50 (концентрация, подавляющая рост 50% клеток в культуре), LC50 (концентрация вещества, вызывающая гибель 50% клеток), EC50 (концентрация, вызывающая снижение функции у 50% клеток).
На сегодня уже имеются определенные достижения использования культуры клеток при изучении хронической токсичности in vitro. При этом продолжительность экспозиции исследуемого вещества как минимум длится пять суток. Инкубация с препаратом может быть как непрерывной, так и в виде нескольких повторных его введений в культуральную среду.
Сравнивая опыты, которые проводят на животных и эксперименты на культуре клеток в условиях in vitro, можно выделить ряд преимуществ. Во-первых, тесты на культуре клеток можно проводить в микроколичествах.
Дозу исследуемого вещества, получаемого каждой клеткой, можно измерять и контролировать с достаточно высокой точностью, что облегчает установку токсической концентрации ксенобиотика. Во-вторых, исследования на культуре клеток дают результаты, позволяющие проводить количественную оценку, изучать зависимости «доза — эффект» и «структура — активность».
В-третьих, преимуществом метода культуры клеток является высокая технологичность процесса исследований и автоматизация значительной их части, возможность проведения скрининга одновременно нескольких веществ и непосредственно на клетках органов человека [8]. Проблема внедрения альтернативных методов изучения токсичности и безопасности различных химических веществ, в т. ч. лекарственных препаратов, в систему доклинических исследований остается актуальной, но вместе с тем еще далеко незавершенной. В ближайшем будущем предстоит включить знания о механизмах, полученные в ходе клеточных и молекулярных исследований, в обширный арсенал данных in vivo, с тем чтобы более подробно описать токсикологические механизмы, а также создать парадигму использования данных in vitro для прогноза токсичности in vivo. Ценность методов in vitro является общепризнанным фактом, однако их повсеместное внедрение может быть реализовано только в результате совместных усилий токсикологов и представителей государственных учреждений.
ИСТОЧНИКИ Гуськова Т.А., Сюбаев Р.Д., Немкова И.Н., Енгалычева Г.Н. Изучение токсичности лекарственных средств in vitro при оценке их токсикологического взаимодействия. Биомедицина. 2010. 5. 74-76.
1. Коршун М.Н., Краснокутская Л.М. Принцип Трех R и пути его реализации в токсиколого-гигиенических исследованиях. Український журнал з проблем медицини праці. 2005. 3–4.
66–74.
2. Трахтенберг І.М., Коваленко В.М., Кокшарьова Н.В., Жмінько П.Г. та ін. Альтернативні методи і тест-системи. Лікарська токсикологія. К.: Авіцена, 2008. 272 с.
3. Afaller W, Balls M, Clotier R et al. European Commision-Enterprise and Industry-REACH – Overview-FAG. Novel advanced in vitro methods for long-term toxicity testing. ATLA. 2001.
29, 4. 393–426.
4. Arturo Anadón et. al. The role of in vitro methods as alternatives to animals in toxicity testing. Expert Opinion on Drug Metabolism Co. KGaA, 2007. 298.
13. Schuppli CA, Fraser D. The interpretation and application of the three Rs by animal ethics committee members.-ATLA. 2005. 33, 5. 487–500.
14. Verstraelen S et al. Improvement of the Bovine Corneal Opacity and Permeability (BCOP) assay as an in vitroalternative to the Draize rabbit eye irritation test. Toxicol In Vitro. 2013 Jun, 27(4): 1298-311.
Источник: Вестник Росздравнадзора, № 5, 2015
Источник: remedium.ru