Разрушение нативной конформации сопровождается утратой функции белков, т. е. приводит к потере его биологической активности. Этот процесс называется денатурацией. Денатурация наступает при разрыве слабых связей, ответственных за формирование вторичной, третичной и четвертичной структуры белка. Большинство белков теряют биологическую активность при изменении свойств среды под действием сильных факторов: в присутствии минеральных кислот, оснований, при нагревании, под влиянием солей тяжелых металлов (Ag, Pb, Hg), органических растворителей, детергентов (амфифильных соединений).
Для большинства белков денатурация сопровождается необратимой потерей их биологической активности. Однако известны примеры ренатурации или обратимой денатурации, например, фермента рибонуклеазы. Рибонуклеаза, глобулярный белок, состоящий из 1 полипептидной цепи, при обработке β- меркаптоэтанолом подвергается денатурации и теряет ферментативную активность, глобула расплетается. Если из среды удалить денатурирующие агенты (путем диализа) каталитическая активность рибонуклеазы восстанавливается, т. е. происходит ренатурация или ренативация белка. Это означает, что рибонуклеаза самопроизвольно восстанавливает из множества возможных комбинаций связей именно один вариант, который возвращает ей биологически активную конформацию.
2. Всё про белок за 5 минут
Шапероновая защита белков in vivo
В клеточной среде белковые молекулы могут иметь нестабильные конформации, находится в неустойчивом состоянии, склонном к агрегации и денатурации. Ренатурация белков в условиях клетки затруднена. Но в организме существуют специальные белки, шапероны, которые способны стабилизировать состояние неустойчивых белков, восстановить нативную конформацию и защитить белки от поражающего воздействия стрессовых ситуаций.
Направления шапероновой защиты
· Защита процессов синтеза белков и формирования трехмерной биологически активной конформации.
Пространственная структура белка (вторичная и третичная) формируется в процессе трансляции (синтеза белка) по мере роста полипептидной цепи. Однако в условиях клеточной среды при высокой концентрации реакционно-способных биомолекул независимая укладка полипептидной цепи в пространстве затруднена. Выбор нативной конформации синтезированного белка обеспечивают белки-шапероны.
На этапе синтеза шапероны-70 (с молекулярной массой около 70 кД) своими гидрофобными радикалами аминокислот связываются с гидрофобными участками растущей цепи белка, защищая от посторонних взаимодействий.
Завершающий этап формирования трехмерной пространственной структуры, т. е. фолдинг высокомолекулярного белка, осуществляется внутри шаперонового комплекса, состоящего из 14 белковых молекул шаперонов – 60, где, находясь в изоляции от других молекул клеточной среды, белок находит свою единственную, наиболее устойчивую конформацию, обладающую биологической активностью.
· Ренатурация, восстановление нативной конформации белков.
Известно, что в условиях клеточной среды с невысокой скоростью может происходить денатурация белковых молекул. Возвращение активного конформационного состояния белков, т. е. их ренатурация, в клетке осложняется тем, что денатурированные молекулы имеют развернутые полипептидные цепи, обнаженные гидрофобные и другие реакционноспособные участки, устанавливающие связи с другими молекулами, что затрудняет возвращение правильной пространственной структуры.
Как понять, что вы едите слишком много белка⁉️
Шапероны-60 помогают вернуть нативную структуру частично поврежденного белка, который попадает в полость шаперонового комплекса, где нет факторов, мешающих ренативации. После восстановления термодинамически выгодной конформации белок возвращается в цитозоль.
Защита белков от действия поражающих факторов.
Такую защиту осуществляет особая группа шаперонов, называемых индуцибельными, т. е. их синтез в нормальных условиях незачительный, а при действии на организм чрезмерных факторов резко усиливается. Эту группу шаперонов относят к белкам теплового шока, т. к. впервые были обнаружены в клетках, после воздействия на них высокой температуры. Белки теплового шока, связываясь с клетками нашего организма, экранируют их, препятствуя дальнейшей деградации под влиянием высокой температуры, низкой температуры, УФО, при резком изменении рН, концентрации веществ, при действии токсинов, тяжелых металлов, при отравлении химическими реактивами, при гипоксии, при инфекции и других стрессовых ситуациях.
Нарушения фолдинга белков могут иметь большие клинические последствия. Прионы – белки, которые являются матрицей для нарушения фолдинга собственных клеточных белков PrP c . В результате образуется форма белка PrP Sc , содержащая большую долю β-структуры, способная к формированию больших агрегатов и устойчивая к протеолитической деградации. Прионовые болезни могут начинаться с инфекции (коровье бешенство, скрепи, болезнь Куру) или с мутации (болезнь Крейцфельда-Якоба).
Классификация белков
Белки
Простые Сложные
Содержат только содержат белковую часть (апопротеин)
аминокислоты и небелковый компонент
Небелковый компонент сложных белков может быть представлен различными веществами.
Источник: infopedia.su
Оптогенетический инструмент управления экспрессией белков in vivo применили для терапии диабета
Китайские ученые создали оптогенетический инструмент, который позволяет точно регулировать экспрессию генов, имитируя нормальную экспрессию в живых системах. Представленная ими схема поможет глубже изучить механизмы экспрессии генов в клетках животных. В рамках работы, опубликованной в Nature Communications, исследователи также продемонстрировали потенциальное применение молекулярного инструмента в качестве терапии диабета первого типа.
Чтобы понимать, как функционирует тот или иной белок, как клетка отвечает на внешние и внутренние сигналы, необходимо иметь возможность анализировать, как именно экспрессируются гены, и, соответственно, вырабатываются белки. Принято считать, что при постоянных внешних условиях концентрация и функции ключевых регуляторных молекул в клетке не сильно меняются или случайным образом колеблются возле фиксированного значения.
Однако многие регуляторные белки, в том числе и транскрипционные факторы, функционируют «пульсирующим» образом и, соответственно, по-разному влияют на клеточную судьбу, ответ клетки на стрессовые условия и дифференциацию. Ученым удалось объяснить механизмы только некоторых таких пульсирующих механизмов. Создание управляемых пульсирующих систем может быть полезным для дальнейшего изучения их механизма и стоящих за ними биологических функций.
Выделение клетками инсулина относится к такой пульсирующей схеме. Инсулин — белковый гормон, который выделяют бета-клетки поджелудочной железы. Инсулин блокирует выделение глюкозы печенью и способствует тому, чтобы клетки использовали глюкозу, поступающую в кровь из пищи.
В исследовательских работах для управления экспрессией генов широко используются влияющие на нее химические вещества. Однако такие химические индукторы долго не распадаются и потому слишком долго влияют на экспрессию. И если в эксперименте на клеточных культурах можно физически убрать воздействующее вещество (поменять среду), то в экспериментах на животных такой возможности нет (нельзя обратно «отобрать» вещество из клеток животного), и практически невозможно динамично регулировать экспрессию, просто добавляя или убирая химическое вещество. Существуют альтернативные системы, в которых экспрессия генов зависит от света, но применение и таких систем сильно ограничено: сложно «доставить» необходимое количество света глубоко в ткани, потому что ткани сами по себе довольно сильно поглощают свет.
Проблема управления белками интересует не только тех, кто занимается экспрессией генов. Ранее нейробиологии разработали химерные белки, которые одновременно обладают и люминесценцией (способностью светиться), и чувствительностью к свету. Такая особенность позволяла им в присутствии субстрата «запускать» самих себя. Эти белки регулировали работу ионных каналов. В отличие от традиционных химических индукторов, субстрат люциферазы — белка, который издает свечение — легко и быстро используется люциферазой, а поэтому ответ белка быстро достигает своего пика и также быстро исчезает, что делает его динамичным.
Группа ученых из Восточно-китайского университета науки и технологий под руководством И Янa (Yi Yang) предложила использовать подобную систему, в которой сочетается химическая и световая регуляция, для управления экспрессией генов в клетках. Ученые решили создать химерный белок, состоящий из включаемого светом транскрипционного фактора и люциферазы.
Для этого они соединили модифицированную люциферазу глубоководной креветки NanoLuc и LOV-домен (light-oxygen-voltage), чувствительный к свету белок растений и грибов, в одну молекулу. При этом LOV-домен хорошо поглощает синий свет (длина волны λ = 440–480 нанометров), а люцифераза NLuc как раз вырабатывает синий свет. Воздействовать на такую систему можно двумя способами: непосредственно светом или предоставляя люциферазе ее субстрат фуримазин. Эксперименты показали, что система действительно функционирует как логический элемент «ИЛИ». Экспрессия контролируемого химерным транскрипционным фактором белка возрастала в 116 раз при добавлении фуримазина с концентрацией 2,5 микромоль, и уменьшалась при дальнейшей увеличении концентрации субстрата.
Рост уровня экспресси белка в зависимости от воздействия на химерный транскрипционным фактор светом и фуримазином
Ting Li et al. / Nature Communications, 2021
По замыслу ученых, люцифераза в транскрипционном факторе быстро использует предоставленный ей субстрат, и как только он заканчивается, транскрипционным фактор перестает активировать транскрипцию гена. Для того чтобы проверить, насколько созданный ими фактор отвечает ожиданиям, исследователи измерили уровень экспрессии контролируемого им белка в зависимости от времени. Согласно результатам измерений, через 4-6 часов после добавления фуримазина уровень синтеза белка достигал максимума, а затем резко снижался.
Далее исследователи протестировали систему in vivo на животных моделях. Печень мышей трансфицировали плазмидами, в которых экспрессия репортерного флуоресцентного белка контролировалась разрабатываемым химерным транскрипционным фактором. После введения мышам фуримазина, экспрессия репортерного белка также достигала максимум через четыре часа и резко снижалась после. При этом амплитуда уровня экспрессии менялась с концентрацией вводимого фуримазина. Кроме того, экспрессию белка можно было повторно «включать» с интервалами в восемь часов.
Также исследователи заметили, что оптимальная доза фуримазина, достаточная для поддержания необходимого уровня глюкозы в крови, была разной в зависимости от интервалов времени между приемами пищи. Возможно, это позволит создать клеточную терапию, дозировку которой можно будет корректировать в зависимости от пищевых привычек пациентов.
Возможности методов оптогенетики давно привлекают исследователей, и они часто экспериментируют с их применением на животных. Например, одни ученые внедрили информацию о песнях в мозг молодых амадин, а другие вернули зрение макакам, превратив их нервные клетки в фоторецепторы.
Источник: myci.ru
Реактивы для трансфекции
Выбор методики трансфекции зависит от типа переносимого материала (ДНК, РНК или белок) и типа клеток, который будет подвергнут трансфекции. Ниже приведены таблицы, с помощью которых вы можете выбрать катионно-липидный трансфекционный реактив и систему трансфекции Neon® от Life Technologies™.